合浦珠母贝幼虫变态中的形态、器官变化及运动

合浦珠母贝(Pinctada fucata), 又称马氏珠母贝(Pinctada martensii), 自然分布于热带和亚热带区域, 是培育海水珍珠的重要母贝之一[1,2]。因其相较于大珠母贝(Pinctada maxima)、珠母贝(Pinctada margaritifera)和企鹅珍珠贝(Pteria penguin)三种大型珍珠贝有着较强的抗逆性、育珠周期短及适宜在中国南海大规模养殖等特点, 合浦珠母贝的珍珠养殖也已成为广东、广西和海南等部分沿海地区支柱性产业之一[3,4]。由此, 合浦珠母贝也早已在遗传育种[5]、苗种繁育[6]、养殖管理[7]、插核育珠、珍珠加工[8]、贝壳及贝肉开发利用[9,10]等领域形成了一条完整的产业链, 其基础研究也早已涵盖形态学分析[11]、摄食生理[12]、分子生物学[13]等各方面。在海洋贝类的养殖生产中, 苗种繁育技术仍然是制约其大规模养殖的关键因素之一。虽自1965年合浦珠母贝就已成功突破人工苗种繁育[14],但幼虫培育后期至变态过程中死亡率较高, 幼虫培育技术水平极不稳定。目前, 合浦珠母贝苗种供应还主要依赖于提供大量亲贝及个体自身较大的排卵量(一次性排卵量为百万级)。以个体间杂交手段, 大规模构建家系的选育方法, 其成功率仍然没有保证。在其他海洋双壳贝类幼虫培育中, 有人试图通过调节幼虫培育密度[15,16], 饵料种类筛选[17,18],调节饵料投喂浓度及比例搭配[19—23], 分析饵料营养价值和幼虫营养需求[24—28], 改进苗种培育设施[29]及理化因子等手段, 来提高幼虫培育成活率和生长速率。但就目前来看, 许多贝类幼虫培育过程中其成活率依然较低, 初始幼虫成功变态至稚贝的比例不及0.1%甚至更低[30,31], 幼虫培育技术仍然是限制某些海洋贝类实现规模化生产的重要因素。

异速生长机制普遍存在于生物生长模式中, 它可以描述生物体某一部分相对生长速率与另外一部分相对生长速率或不同属性之间的联系[32]。即某些对生存能力有显著提升的初生器官相对于整体而言表现为快速生长, 当该器官协调身体各部分的需要后, 则逐渐转变为等速生长或慢速生长, 从而在特定环境中以最小的能量供应获得最优的生存能力[32]。本实验利用光学显微镜观察比较了合浦珠母贝幼虫在生长、变态过程中其形态、器官变化, 观察幼虫和稚贝运动与摄食过程。通过对合浦珠母贝幼虫生长及变态过程中形态、器官的变化及异速生长进行研究, 从而了解某些形态特征及器官优先发育所行使的功能重要性, 揭示幼虫生长及变态过程中的形态变化及内部器官改变的内在规律。有助于从形态学和行为学上掌握合浦珠母贝幼虫在生长发育及变态过程中的生物学信息, 以期为合浦珠母贝苗种培育技术提出改进理念和新思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

合浦珠母贝亲贝[壳长： (62.) mm,n=30]为本课题组在海南省陵水县的新村港(18°25′N,109°58′E)贝架养殖的20月龄贝, 球等鞭金藻(Isochrysis galbana)、小球藻(Chlorella vulgaris)和亚心形扁藻(Platymonas subcordiformis)藻种均为本课题组在实验室用5 L的锥形瓶保种, 实验地点位于海南三亚。

1.2 饵料培养与幼虫培育

实验用单胞藻是在顶部直径为90 cm、底部直径为80 cm、高为74 cm的玻璃钢纤维桶内添加F/2营养液[33]于自然光照条件下一次性培养。单胞藻在投喂时应处于指数生长期且球等鞭金藻和小球藻浓度大于106个/mL、亚心形扁藻浓度大于105个/mL。

合浦珠母贝亲贝从海区运回后, 清除其表面附着物并涮洗干净, 于阴凉处阴干刺激3h, 待亲贝双壳张开, 挑选性腺饱满的个体, 以雌雄比为3:1左右转移至水泥池中进行流水刺激使其自然排卵授精。受精卵经过大约24h发育至D-形幼虫, 停气30min使幼虫上浮, 虹吸法从上层吸出幼虫并用400目筛绢网过滤清洗, 再转移至水泥池中以5个/mL的密度培养。幼虫培育期间每天8：00和18：00投喂球等鞭金藻, 投喂量从前期的1×103个/mL逐渐增加至5×103个/mL; 变态附着后改投喂小球藻和亚心形扁藻混合藻, 投喂量依稚贝摄食情况作相应调整。幼虫与稚贝培育期间换水量从前期每天的20%逐渐增加到50%, 培育期间水温(24.)℃、盐度34.、pH 7.。

1.3 幼虫形态、器官变化及运动与摄食观察

在幼虫培育的1 dph (days post hatching, 孵化后天数)、4 dph、7 dph、10 dph、13 dph、16 dph、19 dph、22 dph、25 dph、28 dph和31 dph, 分别从培育池中取一部分幼虫观察其形态、器官变化, 在显微镜下连接800万像素摄像头借助Toup View 3.7软件拍照并分别测量其壳长、壳高和绞合线长(n=30)。在培育的31—60 dph每隔3天取稚贝观察其形态变化并分别测量其壳长、鳃丝长(第一片鳃丝基部至末端的距离)、鳃丝间距(第一和第二片鳃丝末端的距离)和鳃丝数量(每片鳃的鳃丝数)。合浦珠母贝幼虫阶段, 把幼虫(含103个/mL级的球等鞭金藻)滴入到0.1 mL (2 cm×2 cm×250 μm)浮游植物计数框中, 盖上盖玻片, 用phenix-ph 100显微镜在物镜40倍镜下观察幼虫摄食过程。幼虫附着变态至稚贝时, 取稚贝放入规格为内径3 cm、高2 cm的胚胎皿中, 滴入藻液在显微镜下观察稚贝摄食过程。合浦珠母贝幼虫以大约5个/mL的密度取5 mL放入胚胎皿中, 显微镜下观察幼虫在水中的运动状态; 在胚胎皿中每次加入20个左右的稚贝并加入5 mL海水在显微镜下观察稚贝正常运动状态。

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