不同运动方式和运动时间对小鼠睾酮分泌和精子 - 运动精品杂志社投稿

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不同运动方式和运动时间对小鼠睾酮分泌和精子

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摘要：

雄性动物的精子数量和活力是保证雌性动物受胎率、产仔数和子代健康的重要前提[1]。在雄性生殖系统中，睾丸和附睾是重要的性腺器官[2]。睾丸主要由睾丸曲细精管和管外组织组成，曲细精管是精子生成的场所[3]。睾丸生成的精细胞不具备运动与受精的能力，需要在附睾中完成精子成熟相应的形态变化和功能变化[4]。雄激素是维持性腺功能必不可少的激素[5]。

除性腺激素外，雄性动物生殖能力还受到营养、应激和运动等多种因素影响[6]。其中，运动是改善动物生殖机能的有效方式之一。在畜牧生产中，通常需要给种公猪配备运动场，满足运动的需求，以保证精液品质[7-8]。目前研究运动对生殖能力影响的研究模型多为肥胖且生殖能力受损的小鼠[9]。有研究表明，高脂诱导肥胖大鼠长期负重游泳训练可显著增加大鼠的精子总数、增加精子活动率[10]。相反，间接性耐力会显著增加肥胖大鼠的精子畸形率，降低精子总量[11]。可见不同的运动方式和运动强度对小鼠生殖机能的影响不一，但目前鲜有关于运动对健康青年小鼠生殖能力影响的报道。因此，本实验主要研究力竭运动（Exhaustive Exercise，EE）、短期有氧运动（Acute Aerobic Exercise，AAE）和长期有氧运动（Chronic Aerobic Exercise，CAE）对健康青年雄性小鼠睾酮分泌和生殖的影响及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 不同运动模型小鼠的构建实验所用雄性的C57BL/6J 小鼠均购自广东省实验动物中心（广东佛山）。32 只11 周龄雄性小鼠按体重随机分成4 组（n=8），分别是对照组（CON 组）、力竭运动组（EE 组）、短期有氧运动组（AAE 组）和长期有氧运动组（CAE 组）。EE组训练方法：在跑步机上以10 m/min 的速度跑10 min后休息10 min，休息结束以10 m/min 的速度每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 持续训练3 h，训练结束后迅速采样。AAE 组训练方法：在跑步机上以10 m/min 的速度跑10 min 后休息10 min，休息结束在10 m/min 的速度基础上以每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 的速度持续训练1 h，训练结束后迅速采样。CAE 组训练方法：在跑步机上以10 m/min的速度跑10 min 后休息10 min，休息结束后在10 m/min的速度基础上以每3 min 加2 m/min，加至20 m/min，以20 m/min 的速度持续训练1 h，每天按照上述方式重复训练，每训练5 d 休息2 d，训练2 周后停止训练，最后一次训练结束后24 h 内采样[12]。

1.2 性腺样本的采集、HE 染色及统计方法实验结束后小鼠脱颈法处死，腹部涂抹75% 酒精，开腹后迅速采集一侧完整睾丸和附睾置于4%的多聚甲醛中固定过夜，然后经过乙醇溶液脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。HE 染色过程：经二甲苯脱蜡，乙醇溶液脱水，苏木精伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片。

使用ImageJ 1.8.0 统计睾丸曲细精管空腔绝对面积。附睾尾每个样品随机选取10 个视野，统计该视野不规则附睾管的比率，最后求均值。小鼠处死后迅速分离附睾，转移至1 mL、37℃生理盐水中，剪刀剪碎附睾，37℃孵育10 min 后，移液枪轻轻吹匀精子悬浮液后，用血球计数板测定精子数量；将悬浮液均匀抹于玻片上风干，甲醇固定5 min，伊红染色1 h，蒸馏水浸洗。风干后在400 倍光学显微镜模式下观察2000 个精子细胞的形态，统计精子畸形率。

1.3 血清样品检测采集小鼠全血，4℃、3000 r/min离心25 min，吸取上层血清-20℃保存备用。血清睾酮水平的检测：采用Testosterone assey kit（USA，R&D system）检测。

1.4 睾丸样本的采集及荧光定量PCR 检测小鼠处死后分别取出取完整睾丸置于液氮中速冻，然后将样品转移至冰箱中-80℃保存。提取睾丸组织总RNA，利用试剂 TRIzol，常规方法抽提，荧光定量PCR 检测睾丸中睾酮合成代谢转运相关基因包括类固醇急性转运蛋白（Steroidogenic Acute Regulatory Protein，STAR）、3β-羟基类固醇脱氢酶异构酶2（Hydroxy-Delta-5-Steroid Dehydrogenase,3 Beta-And Steroid，3β-HSD）、17β羟类固醇脱氢酶（Hydroxysteroid 17-Beta Dehydrogenase，17β-HSD）、类固醇5α-还原酶1（Steroid 5 Alpha-Reductase 1，SRD5A1）、类固醇5α-还原酶2（Steroid 5 Alpha-Reductase 2，SRD5A2）和细胞色素P450 胆固醇侧链裂解酶（Cytochrome P450scc，P450scc）。以β-actin作为内参，对获得的数据进行处理。基于各目的基因与内参基因的扩增效率接近，根据公式计算目的基因相对于内参基因的比值来反映各基因的相对表达丰度：2-△△Ct=2-（Ct 目的基因-Ct 内参基因），其中Ct目的基因为目的基因的Ct 值，Ct内参基因为内参基因的Ct 值。

表1 荧光定量PCR 所用引物序列

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